Disunting oleh Peter Sarnow, Sekolah Perubatan Universiti Stanford, Universiti Stanford, California, diluluskan pada 25 Disember 2020 (disemak pada 25 Oktober 2020)
Kami melaporkan interaksi antara subunit dalam replikasi kompleks transkripsi coronavirus, yang penting untuk replikasi dan pemuliharaan evolusi.Kami memberikan bukti bahawa domain NiRAN yang dikaitkan dengan nsp12 mempunyai aktiviti pemindahan nukleosida monofosfat (NMP) dalam trans, dan mengenal pasti nsp9 (protein pengikat RNA) sebagai sasarannya.NiRAN memangkinkan ikatan kovalen bahagian NMP kepada terminal amino nsp9 yang dipelihara dalam tindak balas yang bergantung pada ion Mn2+ dan sisa Asn terpelihara bersebelahan.Telah didapati bahawa aktiviti NiRAN dan nsp9 NMPylation adalah penting untuk replikasi coronavirus.Data tersebut membolehkan kami menghubungkan aktiviti penanda enzim virus bersarang ini kepada pemerhatian sebelumnya dalam hipotesis bahawa permulaan sintesis RNA dalam kelas virus RNA adalah konsisten dari segi fungsi dan evolusi.
Polimerase RNA yang bergantung kepada RNA (RdRps) Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, dan 12 keluarga lain) dikaitkan dengan domain terminal amino (terminal N) dalam protein bukan struktur (nsp) yang dikeluarkan daripada poliprotein, dipanggil NiRAN 1ab terdiri daripada protease utama virus (Mpro).Sebelum ini, aktiviti GMPylation/UMPylation/UMPylation virus arteri NiRAN-RdRp nsp sendiri telah dilaporkan, dan dicadangkan untuk menjana sementara untuk pemindahan nukleosida monofosfat (NMP) kepada virus (setakat ini tidak diketahui) dan/atau Perkara biopolimerisasi sel.Di sini, kami menunjukkan bahawa coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E dan Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) mempunyai aktiviti NMPylation yang bergantung kepada Mn2+, yang diperoleh daripada nsp9 melalui pembentukan nsp9 yang dimediasi Mpro Selepas nsps mengapit terminal-N dilepaskan secara proteolitik, fosforamidat terikat pada amina primer (N3825) di terminal-N nsp9.Uridin trifosfat ialah nukleotida pilihan dalam tindak balas ini, tetapi adenosin trifosfat, guanosin trifosfat, dan sitidin trifosfat juga merupakan substrat bersama yang sesuai.Kajian mutasi menggunakan protein nsp9 dan nsp12 coronavirus rekombinan dan mutan HCoV-229E yang direka bentuk secara genetik menentukan sisa-sisa yang diperlukan untuk nsp9 NMPylation dan replikasi virus yang dimediasi NiRAN dalam kultur sel.Data mengesahkan ramalan sisa tapak aktif NiRAN dan menentukan peranan penting sisa nsp9 N3826 dalam nsp9 NMPylation dan replikasi virus secara in vitro.Sisa ini adalah sebahagian daripada jujukan tripeptida NNE terminal N terpelihara dan terbukti sebagai satu-satunya sisa invarian nsp9 dan homolognya dalam keluarga coronavirus.Kajian ini menyediakan asas yang kukuh untuk kajian fungsional aktiviti NMPylation bagi virus bersarang lain dan mencadangkan sasaran yang mungkin untuk pembangunan ubat antivirus.
Virus RNA terkandas positif Nidovirales menjangkiti pelbagai vertebrata dan invertebrata (1, 2).Perintah itu pada masa ini termasuk 14 keluarga (3), yang mana keluarga Coronavirus telah dikaji secara meluas dalam tempoh 20 tahun yang lalu.Pada masa itu, tiga coronavirus zoonosis muncul daripada perumah haiwan dan menyebabkan wabak berskala besar jangkitan pernafasan yang teruk pada manusia.Termasuk pandemik berterusan yang disebabkan oleh penyakit berjangkit akut yang teruk.Sindrom Pernafasan Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirus berkongsi organisasi genom yang sama, dan subunit kompleks transkripsi-replikasi terikat membran (RTC) dikodkan dalam dua pertiga terminal 5-?² dan subunit struktur utama zarah virus, serta beberapa aksesori. .Protein, dikodkan dalam 3??² hujung pertiga genom (1).Kecuali untuk satu keluarga virus planarian (Monoviridae) (8), semua virus bersarang mengekodkan subunit RTC dalam dua bingkai bacaan terbuka (ORF) ORF1a dan ORF1b yang besar, yang diterjemahkan daripada RNA genomik.ORF1a mengekod poliprotein (pp) 1a, dan ORF1a dan ORF1b bersama-sama mengekod pp1ab.Dengan penyertaan umum protease utama (Mpro) yang dikodkan oleh ORF1a, kedua-dua pp1a dan pp1ab diproses secara proteolitik menjadi pelbagai protein bukan struktur (nsps), juga dikenali sebagai 3CLpro, kerana ia mempunyai homologi dengan 3Cpro picornavirus ( 9).Npss ini difikirkan akan dipasang menjadi RTC dinamik yang besar, memangkinkan sintesis RNA genom (replikasi) dan satu set RNA subgenomik (transkripsi), dan digunakan untuk menyelaraskan ekspresi ORF yang terletak di hilir ORF1b (10? ? ?12).
RTC teras termasuk RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helikase (HEL1) (14, 15) dan beberapa enzim pemprosesan RNA, yang kebanyakannya dikodkan dalam ORF1b dan dalam keluarga coronavirus Ia mengandungi nsp12-nsp16 dan nsp9-nsp12 dalam keluarga Arterioviridae (lihat rujukan 10ââ 12).RdRp dan HEL1 mewakili dua (satu perlima) domain terpelihara virus sarang burung dan mempunyai homologi antara virus RNA yang lain.Replika teras dipercayai dibantu oleh subunit lain, termasuk beberapa nsps kecil yang dilepaskan dari kawasan terminal karboksi (terminal C) pp1a, hiliran Mpro (coronavirus nsp5 dan virus arteri nsp4, masing-masing).Mereka mempunyai perlindungan khusus keluarga yang terhad dan pelbagai aktiviti (disemak dalam rujukan 10ââ12).
Secara relatif baru-baru ini, domain dengan ciri motif jujukan unik ditemui di terminal amino (N-terminus) bersebelahan dengan RdRp dalam semua virus bersarang, tetapi tiada virus RNA lain (16).Berdasarkan lokasi dan aktiviti pemindahan nukleotida (nucleoside monofosfat [NMP] transferase), domain ini dinamakan NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Gabungan dwi-domain NiRAN-RdRp membentuk nsp12 dalam keluarga Coronaviridae dan nsp9 dalam keluarga Arterioviridae, dan dalam nestoviridae lain, NiRAN-RdRp dijangka akan dikeluarkan sebagai nsp bebas daripada poliprotein virus.Dalam coronavirus, domain NiRAN mengandungi ??1/450 sisa dan disambungkan ke domain RdRp terminal-C melalui kawasan pemaut (16?19).Dalam Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), nsp9 rekombinan menunjukkan aktiviti UMPilasi dan GMPylation bergantung kepada ion Mn2+ dan GMPylation, yang bergantung kepada tiga asas jujukan terpelihara dalam nestovirus, AN, BN dan CN Sisa dalam jujukan.Di mana N bermaksud NiRAN) (16).Bahagian tepi terminal-N motif ini adalah motif preAN yang kurang konservatif.Sebahagian daripada sisa ini juga dipelihara dalam kinase protein yang berkaitan dengan jauh, di mana ia telah ditunjukkan terlibat dalam mengikat nukleosida trifosfat (NTP) dan aktiviti pemangkin (20, 21).Selaras dengan pemerhatian ini, beberapa sisa tapak aktif utama dalam pseudokinase SelO daripada Pseudomonas syringae boleh dipasang dengan superkompleks SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 yang diterbitkan baru-baru ini.Sisa NiRAN Coronavirus terpelihara ditindih dalam struktur mikro elektron.Protein rekombinan (17).Adalah spekulasi bahawa U/GMPylation yang didokumenkan (diri) akan menghasilkan keadaan sementara untuk memindahkan NMP kepada substrat (yang tidak diketahui pada masa ini) (16), dan persamaan struktur antara NiRAN dan kinase protein (17, 19) ) Adalah hipotesis bahawa NiRAN mengubah suai protein lain.
Banyak ciri, termasuk perkaitan sistematiknya yang unik dan unik dengan virus bersarang dan pemisahan genetik daripada RdRp, menjadikan NiRAN sebagai enzim pengawalseliaan utama yang munasabah untuk virus bersarang, yang penting untuk kemunculan dan identiti mereka.Sebelum ini, tiga kemungkinan fungsi yang melibatkan NiRAN untuk mengawal terjemahan genom/subgenomik atau replikasi/transkripsi dipanggil.Apabila mempertimbangkan data yang terhad dan tidak lengkap yang tersedia pada masa itu, setiap fungsi mempunyai kelebihan dan kekurangannya (16).Dalam penyelidikan ini, kami berhasrat untuk menggabungkan kajian genetik biokimia dan terbalik bagi coronavirus yang mewakili dua genera, dan meletakkan penemuan kami dalam latar belakang evolusi mutasi semula jadi keluarga coronavirus, untuk mendapatkan pandangan tentang alam Misteri ini.Kami melaporkan kemajuan besar dalam pemahaman NiRAN melalui pengenalpastian sasaran semula jadi dalam RTC, yang (antara tiga hipotesis yang ada) menyumbang kepada peranan domain ini dalam memulakan sintesis RNA virus bersarang.Penyelidikan ini juga membuka kemungkinan untuk peranan lain NiRAN pada antara muka hos virus.
Untuk mencirikan sifat enzimatik domain NiRAN berkaitan nsp12 virus korona, kami menghasilkan bentuk rekombinan coronavirus manusia 229E (HCoV-229E) nsp12 dalam E. coli, dengan tag His6 di terminal-C, dan menggabungkan protein dengan [α32-P ] Inkubasi bersama-sama dengan NTP dengan kehadiran MnCl2 seperti yang diterangkan dalam Bahan dan Kaedah.Analisis produk tindak balas menunjukkan kehadiran protein berlabel radio yang berhijrah bersama nsp12 (106 kDa), menunjukkan bahawa coronavirus nsp12 memangkinkan pembentukan tambahan protein-NMP kovalen, yang lebih disukai dibentuk dengan uridin monofosfat (UMP) (Rajah 1A) Dan B).Analisis kuantitatif menunjukkan bahawa berbanding dengan nukleotida lain, keamatan isyarat penggabungan UMP meningkat sebanyak 2 hingga 3 kali ganda (Rajah 1C).Data ini konsisten dengan aktiviti pemindahan NMP yang diramalkan bagi domain NiRAN bagi coronavirus (16), tetapi menunjukkan bahawa keutamaan nukleotida domain NiRAN bagi coronavirus dan virus arteri adalah berbeza.
Aktiviti NMPilasi sendiri HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) diinkubasi dengan [α-32P] NTP yang ditetapkan dengan kehadiran 6 mM MnCl2 selama 30 minit (lihat Bahan dan Kaedah untuk butiran).Produk tindak balas dipisahkan oleh SDS-PAGE dan diwarnai dengan biru cemerlang Coomassie.(B) Protein berlabel radio divisualisasikan oleh pengimejan fosforus.Kedudukan nsp12-His6 dan penanda jisim molekul protein (dalam kilodalton) ditunjukkan dalam A dan B. (C) Keamatan isyarat radioaktif (min ± SEM) ditentukan daripada tiga eksperimen bebas.*P≤0.05.Kekuatan isyarat (peratusan) adalah berkaitan dengan UTP.
Walaupun aktiviti enzim berkaitan NiRAN telah terbukti penting untuk replikasi EAV dan SARS-CoV dalam kultur sel (16), fungsi NiRAN khusus dan sasaran berpotensi belum ditentukan.Persamaan struktur yang dilaporkan baru-baru ini antara NiRAN dan keluarga protein dengan lipatan seperti protein kinase (17, 22) mendorong kami untuk menguji hipotesis bahawa NiRAN memangkinkan NMPylation protein lain.Kami menjana satu set sasaran homolog yang berpotensi, termasuk protein bukan struktur yang dikodkan oleh HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), setiap satu mengandungi teg His6 terminal C (lampiran SI, Jadual S1), Dan inkubasi protein ini dengan [α32-P] uridin trifosfat ([α32-P]UTP) dengan ada atau tiada nsp12.Albumin serum lembu dan protein gabungan MBP-LacZα yang dihasilkan dalam E. coli berfungsi sebagai kawalan (Rajah 2A, lorong 1 hingga 7).Protein berlabel radio telah dianalisis oleh elektroforesis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) dan autoradiografi, dan didapati bahawa terdapat isyarat radioaktif yang kuat dalam tindak balas yang mengandungi nsp12 dan nsp9.Kedudukan isyarat sepadan dengan jisim molekul nsp9, menunjukkan UMPylation nsp12-mediated nsp9 (Rajah 2B, trek 7).Tiada protein ujian lain didapati UMPylated, yang membawa kita untuk membuat kesimpulan bahawa nsp9 adalah substrat khusus nsp12.Selaras dengan data NMPylation sendiri yang ditunjukkan dalam Rajah 1, nsp12 mampu memindahkan keempat-empat NMP kepada nsp9, walaupun kecekapannya berbeza, UMP> adenosine monofosfat (AMP)> guanosine monofosfat (GMP)> cytidine monofosfat (CMP) ) ( Gambar).3 A dan B).Di bawah keadaan yang digunakan dalam ujian ini (memendekkan masa tindak balas dan pendedahan, mengurangkan kepekatan nsp12; bahan dan kaedah), NMPilasi kendiri nsp12 tidak dapat dikesan (bandingkan Rajah 2B, lorong 7, dan Rajah 1B), yang terbukti berkesan (Dan berbilang pusingan) UMP berpindah dari nsp12 ke nsp9.Aktiviti pemindahan UMP memerlukan kehadiran ion Mn2+, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3C, manakala hanya aktiviti pemindahan UMP yang minimum diperhatikan dengan kehadiran Mg2+, dan tiada aktiviti dengan kehadiran dua kation divalen lain yang diuji.Data yang sama diperolehi dalam ujian NMPylation yang mengandungi cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), dan adenosine triphosphate (ATP) (SI lampiran, Rajah S1).
HCoV-229E nsp12-pengantara UMPilasi nsp9.Satu siri substrat protein (termasuk albumin serum lembu, MBP-lacZα, dan satu siri nsps HCoV-229E yang dilabelkan dengan C-terminal His6 yang dikodkan oleh ORF1a) telah digunakan untuk menilai aktiviti UMPylation HCoV-229E nsp12-His6⁺-pengantara. protein.Inkubasi protein dengan [α-32P] UTP selama 10 minit dalam ketiadaan (A) atau kehadiran (B) nsp12 seperti yang diterangkan dalam bahan dan kaedah.Di bahagian atas A dan B, gel SDS-polyacrylamide yang diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue ditunjukkan, dan di bahagian bawah A dan B, autoradiogram yang sepadan ditunjukkan.Kedudukan penanda jisim molekul protein (dalam kilodalton) diberikan di sebelah kiri.Kedudukan nsp12-His6 (B, atas) dan isyarat radioaktif yang diperhatikan semasa pengeraman nsp12-His6 dengan nsp9-His6 (B, lorong 7) juga ditunjukkan, yang menunjukkan bahawa [α-32P]UMP ke nsp9-His6 (12.9 kDa), yang tidak diperhatikan untuk protein lain yang diuji.
Pencirian biokimia dan virologi pengantaraan HCoV-229E NiRAN bagi nsp9 NMPylation.(A dan B) Peranan substrat bersama nukleotida yang digunakan dalam tindak balas.Nsp12-His6 dan nsp9-His6 dicampur dan diinkubasi dengan kehadiran NTP [α-32P] berbeza dalam ujian NMPylation standard.(A, atas) nsp9-His6 yang diwarnai Coomassie dipisahkan oleh SDS-PAGE.(A, bawah) Autoradiograf kawasan yang sama gel.(B) Aktiviti relatif (min ± SEM) dengan kehadiran kofaktor nukleotida yang ditetapkan ditentukan daripada tiga eksperimen bebas.*P≤0.05.(C) Peranan ion logam.Ditunjukkan ialah ujian NMPylation standard dengan kehadiran [α-32P] UTP dan ion logam yang berbeza, setiap satu dengan kepekatan 1 mM.Dalam C, bahagian atas, Coomassie stained nsp9-His6 ditunjukkan, dan dalam C, bahagian bawah, autoradiografi yang sepadan ditunjukkan.Saiz protein berlabel (dalam kilodalton) ditunjukkan di sebelah kiri A dan C. (D) Bentuk mutan HCoV-229E nsp12-His6 yang membawa penggantian asid amino yang ditentukan adalah dalam [α-32P]UTP, seperti yang diterangkan dalam Bahan dan Kaedah.Nsp9-His6 berlabel radio yang dihasilkan dalam tindak balas NMPylation dikesan oleh pengimejan fosforilasi (D, atas).Aktiviti relatif berbanding dengan protein jenis liar (wt) ditunjukkan dalam D, dan bahagian bawah diambil sebagai purata (± SEM) daripada tiga eksperimen Bebas.Asterisk menunjukkan penggantian sisa yang tidak terpelihara.(E) Titer virus dalam supernatan kultur sel p1 diperoleh 24 jam selepas jangkitan ditentukan oleh ujian plak.Penggantian kodon dalam domain NiRAN bagi mutan HCoV-229E yang direka bentuk ditunjukkan (penomboran sisa adalah berdasarkan kedudukannya dalam pp1ab).Mutan tapak aktif RdRp kekurangan replikasi nsp12_DD4823/4AA digunakan sebagai kawalan.
Untuk mendapatkan pemahaman yang lebih mendalam tentang tapak aktif NiRAN dan menentukan residu yang berkaitan dengan aktiviti transferase NMP khusus nsp9, kami melakukan analisis mutasi, di mana kami menggantikan residu konservatif dalam motif NiRAN AN, BN dan CN ( 16) Ia adalah Ala (lampiran SI, Rajah S2).Di samping itu, kesan penggantian Arg-to-Lys atau Lys-to-Arg konservatif telah dinilai dalam dua kes.Sebagai kawalan (negatif), sisa yang tidak atau kurang terpelihara dalam domain NiRAN coronavirus dan virus bersarang lain digantikan dengan Ala. Menggantikan K4116A (dalam motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif BN) dan D4280A (CN) dengan ketara mengurangkan atau bahkan menghapuskan nsp9 NMPylation melalui nsp12, manakala protein dengan penggantian konservatif (R4178K), K4116R) mengekalkan 60% dan 80% daripada aktiviti mereka, yang menunjukkan bahawa kelonggaran sekatan pada bahagian masing-masing. rantai adalah sensitif dari segi fizikokimia (Rajah 3D).Menggantikan beberapa sisa terpelihara lain E4145A, D4273A, F4281A dan D4283A adalah lebih kurang berbahaya, dan nsp9 UMPilasi hanya dikurangkan secara sederhana.Keputusan yang sama diperolehi dalam tindak balas nsp9 NMPylation yang melibatkan NTP lain (Rajah 3D dan lampiran SI, Rajah S3), mengesahkan bahawa kesan yang diperhatikan pada penggantian asid amino tertentu adalah bebas daripada jenis substrat bersama nukleotida yang digunakan.Seterusnya, kami menguji kemungkinan kesan penggantian nsp12 ini pada replikasi coronavirus dalam budaya sel.Untuk tujuan ini, kami menggunakan templat DNA pelengkap (cDNA) kejuruteraan genetik yang sesuai yang diklon dalam virus vaccinia rekombinan (23, 24) untuk menyalin 5 -7 sel.Pentitratan progeni virus berjangkit yang dihasilkan dalam sel ini menunjukkan bahawa kebanyakan mutan HCoV-229E NiRAN tidak boleh dilaksanakan (Rajah 3E).Sekumpulan mutan virus yang tidak berdaya maju termasuk alternatif yang telah ditunjukkan untuk menghapuskan atau mengurangkan dengan ketara aktiviti transferase secara in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), tetapi terdapat dua alternatif lain (K4116R, E4145A) 8 % terpelihara?Aktiviti NMPylation in vitro mereka menunjukkan bahawa sekatan tambahan terlibat.Begitu juga, dua mutasi lain (R4178K, F4281A) yang menyebabkan penurunan sederhana dalam aktiviti NMPylation in vitro NiRAN menghasilkan virus hidup, bagaimanapun, virus ini mengurangkan titer dengan ketara melalui replikasi.Selaras dengan data aktiviti in vitro yang ditunjukkan dalam Rajah 3D, menggantikan empat sisa lain yang tidak dipelihara dalam coronavirus dan/atau virus bersarang lain (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) menghasilkan virus yang berdaya maju. titer yang dikurangkan secara sederhana berbanding virus jenis liar (Rajah 3E).
Untuk mengkaji sama ada aktiviti pemindahan NMP pengantaraan NiRAN bergantung pada domain RdRp aktif, dua residu Asp terpelihara yang terlibat dalam penyelarasan ion logam divalen (11) dalam RdRp motif C telah digantikan dengan Ala. Protein yang terhasil adalah nsp12_DD4823/4AA mengekalkan aktiviti NMPilasi nsp9nya, menunjukkan bahawa aktiviti NMPilasi nsp12-pengantara in vitro nsp9 tidak memerlukan aktiviti polimerase (Lampiran SI, Rajah S4).
Selepas menubuhkan aktiviti pemindahan NMP-nsp9 khusus untuk nsp12, kami cuba mencirikan penambahan NMP-nsp9 dengan spektrometri jisim (MS).Spektrum jisim protein lengkap HCoV-229E nsp9 rekombinan menunjukkan puncak pada 12, 045 Da (Rajah 4A).Penambahan nsp12 tidak mengubah kualiti nsp9, menunjukkan bahawa nsp12 dan nsp9 tidak akan membentuk kompleks yang stabil di bawah keadaan yang digunakan (denaturasi) (Rajah 4A).Dengan kehadiran UTP dan GTP, pengukuran jisim tindak balas yang mengandungi nsp9 dan nsp12 masing-masing menunjukkan bahawa jisim protein UTP bergerak 306 Da, dan jisim protein GTP bergerak 345 Da, menunjukkan bahawa setiap molekul nsp9 mengikat UMP atau GMP. (Gambar 4) C dan D).Adalah spekulasi bahawa tenaga yang diperlukan untuk nsp9 NMPylation pengantaraan NiRAN berasal daripada hidrolisis NTP dan pelepasan pirofosfat.Walaupun lebihan molar 10 kali ganda nsp9 (sasaran) daripada nsp12 (enzim) digunakan dalam tindak balas ini, NMPylation hampir lengkap nsp9 diperhatikan, menunjukkan bahawa interaksi antara nsp12 dan nsp9 adalah jangka pendek, dan nsp12 boleh NMPylate lebih banyak nsp9 molekul in vitro.
NMPilasi tunggal nsp9 dengan kehadiran nsp12 dan UTP atau GTP.Ditunjukkan ialah spektrum jisim protein lengkap yang dipisahkan bagi HCoV-229E nsp9 (lampiran SI, Jadual S1) (AD).(A) nsp9 sahaja, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 dengan kehadiran UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 dengan kehadiran GTP.
Untuk menentukan residu nsp9 UMPylated oleh nsp12, nsp9-UMP telah dibelah dengan trypsin.Peptida yang terhasil dipisahkan oleh kromatografi cecair berprestasi tinggi nano (HPLC) dan dianalisis dengan spektrometri jisim tandem (MS/MS) dalam talian.Analisis data menggunakan pakej perisian Byonic (Metrik Protein) menunjukkan UMPilasi asid amino terminal-N.Ini disahkan secara manual.Spektrum jisim tandem peptida prekursor [UMP]NNEIMPGK (lampiran SI, Rajah S5A) mendedahkan serpihan pada 421 m/z, menunjukkan bahawa UMP mengikat kepada residu 1 nsp9.
Pada terminal-N nsp9, Asn dipelihara dalam kalangan ahli Orthocoronavirinae (lampiran SI, Rajah S6).Walaupun kami percaya bahawa nitrogen amina primer N-terminal ialah penerima yang paling berkemungkinan untuk UMP, kami memutuskan untuk mendapatkan bukti tambahan tentang NMP mengikat di terminal N.Atas sebab ini, peptida N-terminal NMPylated dan NMPylated N-terminal nsp9 yang disucikan oleh HPLC diperolehi dengan kehadiran aseton dan natrium sianoborohidrida.Di bawah keadaan ini, hanya amina primer bebas boleh diubah suai dengan propil (25).Peptida terbitan N-terminal nsp9 dengan jujukan NNEIMPGK mengandungi dua amina utama, satu di terminal-N Asn dan satu lagi di rantai sisi Lys di terminal-C.Oleh itu, kumpulan propil boleh diperkenalkan pada kedua-dua hujungnya.Kromatogram ion yang diekstrak bagi peptida bukan NMPylated ditunjukkan dalam lampiran SI, Rajah S5B.Seperti yang dijangkakan, N-terminal dan C-terminal (mono)propylated (lampiran SI, Rajah S5B, lorong atas) dan peptida terpropilasi (lampiran SI, Rajah S5B, lorong bawah) boleh dikenal pasti.Corak ini berubah dengan penggunaan peptida terminal N NMPylated bagi nsp9.Dalam kes ini, hanya peptida propil C-terminal boleh dikenal pasti, tetapi peptida propiled N-terminal dan peptida dipropylated tidak dikenal pasti (Lampiran SI, Rajah S5C), menunjukkan bahawa UMP telah dipindahkan ke amina primer N-terminal Untuk mengelakkan ini. kumpulan daripada membuat perubahan.
Seterusnya, kami menggantikan (dengan Ala atau Ser) atau memadamkan sisa terpelihara di terminal N nsp9 untuk menentukan kekangan khusus sasaran.Berdasarkan data MS kami yang menunjukkan bahawa NiRAN membentuk tambahan nsp9-NMP dengan amina utama residu N-terminal nsp9, kami membuat hipotesis bahawa nsp9 NMPylation memerlukan protease induk virus (Mpro, nsp5) untuk melepaskan nsp9 N-terminal daripada prekursor poliproteinnya.Untuk menguji hipotesis ini, kami menghasilkan protein prekursor nsp7-11 yang mengandungi nsp9 dalam E. coli dan melakukan ujian NMPylation standard dengan kehadiran [α-32P] UTP (bahan dan kaedah).Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5A (lorong 3), prekursor nsp7-11 yang tidak dipotong tidak dilabel radio dengan nsp12.Sebaliknya, jika nsp7-11 dibelah oleh nsp5 rekombinan untuk melepaskan nsp9 (dan nsps lain) daripada prekursor, protein berlabel radio yang berhijrah dengan nsp9 dikesan, mengesahkan kesimpulan kami bahawa pembentukan NiRAN dan N- Selektif kovalen nsp9-NMP tambahan. .Amina primer terminal bagi Asn-terminal (kedudukan 3825 dalam pp1a/pp1ab).Kesimpulan ini juga disokong oleh eksperimen menggunakan konstruk nsp9, yang mengandungi satu atau dua residu tambahan di terminal-N.Dalam kedua-dua kes, UMPylation pengantara NiRAN bagi nsp9 telah dimansuhkan (Lampiran SI, Rajah S7).Seterusnya, kami menghasilkan protein dengan satu atau dua residu Asn yang dipadamkan daripada urutan peptida 3825-NNEIMPK-3832 di terminal N nsp9.Dalam kedua-dua kes, nsp9 UMPylation telah disekat sepenuhnya (Rajah 5B), memberikan bukti tambahan bahawa nsp9 N-terminus sebenar bertindak sebagai reseptor NMP.
Pemprosesan proteolitik nsp9 dan peranan residu N-terminal dalam UMPylation pengantara nsp12.(A) nsp9 UMPylation memerlukan nsp9 N-terminal percuma.Nsp7-11-His6 pra-inkubasi pada suhu 30 °C dalam penimbal pengesanan NMPylation yang mengandungi UTP dengan kehadiran atau ketiadaan Mpro rekombinan (nsp5-His6).Selepas 3 jam, mulakan ujian NMPylation dengan menambah nsp12-His6 seperti yang diterangkan dalam Bahan dan Kaedah.Tindak balas yang mengandungi nsp5-His6 (lorong 1) dan nsp9-His6 (lorong 2) digunakan sebagai kawalan.Selepas 10 minit, tindak balas telah ditamatkan dan campuran tindak balas dipisahkan oleh SDS-PAGE.Protein telah diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue (A, atas).Prekursor Nsp7-11-His6 dan produk yang diproses hasil daripada belahan pengantara nsp5-His6 ditunjukkan di sebelah kanan.Sila ambil perhatian (disebabkan saiznya yang kecil) bahawa nsp7 dan nsp11-His6 tidak dapat dikesan dalam gel ini, dan tindak balas ditambah dengan nsp5-His6 (lorong 1 dan 4; kedudukan nsp5-His6 ditunjukkan oleh bulatan pepejal) atau nsp9-His6 (Lane 2) mengandungi sejumlah kecil MBP (ditunjukkan oleh bulatan terbuka) sebagai kekotoran sisa kerana ia dinyatakan sebagai protein gabungan MBP (lampiran SI, Jadual S1).(B) Varian Nsp9-His6 tidak mempunyai satu atau dua residu Asn terminal N (penomboran sisa mengikut kedudukan dalam pp1a/pp1ab) dan disucikan dan diinkubasi dengan nsp12-His6 dan [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE yang diwarnai dengan Coomassie ditunjukkan di bahagian atas, B, autoradiograf yang sepadan ditunjukkan di bahagian bawah.Kedudukan penanda berat molekul (dalam kilodalton) ditunjukkan di sebelah kiri.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal terpelihara residu telah digantikan dengan Ala atau Ser, dan jumlah protein yang sama digunakan dalam tindak balas UMPylation pengantara nsp12-His6.Produk tindak balas telah dipisahkan oleh SDS-PAGE dan diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue (C, atas), dan radiolabeled nsp9-His6 telah dikesan oleh pengimejan phosphorescence (C, tengah).Menggunakan protein jenis liar (wt) sebagai rujukan (ditetapkan kepada 100%), aktiviti NMPylation relatif (min ± SEM) dikira daripada tiga eksperimen bebas.(D) Titer virus dalam supernatan kultur sel p1 sel Huh-7 yang dijangkiti sel Huh-7 jenis liar HCoV-229E, dan mutan yang membawa penggantian asid amino yang ditetapkan dalam nsp9 ditentukan oleh ujian plak.Motif RdRp kekurangan replikasi C mutan berganda DD4823/4AA digunakan sebagai kawalan negatif.
Terminal-N nsp9 (terutamanya kedudukan 1, 2, 3, dan 6) sangat terpelihara di kalangan ahli subfamili Orthocoronavirinae (lampiran SI, Rajah S6).Untuk mengkaji kemungkinan peranan sisa-sisa ini dalam nsp12-pengantara nsp9 NMPylation, dua residu Asn berturut-turut pada N-terminus nsp9 telah digantikan dengan Ala atau Ser (sendirian atau gabungan).Berbanding dengan nsp9 jenis liar, menggantikan N3825 dengan Ala atau Ser menghasilkan lebih daripada pengurangan dua kali ganda dalam UMPylation pengantara nsp12 (Rajah 5C).Selaras dengan kesimpulan kami bahawa NMPilasi berlaku pada amina primer N-terminal dan bukannya rantaian sisi residu N-terminal, kami memerhatikan sisa NMPylation yang ketara dengan penggantian N3825A dan N3825S.Menariknya, jika Asn kedua digantikan dengan Ala atau Ser, nsp9 UMPilasi dikurangkan dengan lebih kuat (lebih daripada 10 kali ganda), manakala penggantian Ala pada kedudukan 3, 4, dan 6 hanya memberi kesan sederhana pada nsp9 UMPilasi (Rajah 2). ).5C).Keputusan yang sama diperoleh menggunakan ATP, CTP atau GTP (lampiran SI, Rajah S8).Secara kolektif, data ini menunjukkan peranan utama N2826 (kedudukan 2 dalam nsp9) dalam nsp9 NMPylation.
Untuk mendapatkan bukti tambahan tentang korelasi fungsi antara N-terminus nsp9 dan NMPylation, kami melakukan penjajaran jujukan berbilang (MSA) bagi jujukan nsp9 keluarga Coronavirus (berbeza antara 104 dan 113 residu) (Lampiran SI, Rajah. S6).Secara keseluruhannya, dalam 47 spesies (dikenali dan diduga) daripada 5 genera subfamili Orthocoronavirinae yang menjangkiti mamalia, burung dan perumah reptilia yang berbeza, hanya 8 sisa secara keseluruhannya didapati tidak berubah.Perubahan yang paling meluas, termasuk pemadaman dan sisipan, diperhatikan dalam kitaran antara elemen struktur sekunder nsp9, seperti yang ditentukan oleh kajian struktur terdahulu (26 ??28).Lima sisa invarian ditemui dalam helai β dan heliks α bahagian terminal-C nsp9.Tiga sisa invarian membentuk motif NNE bagi terminal N bagi nsp9.Telah didedahkan bahawa Asn kedua motif ini adalah satu-satunya sisa invarian, yang turut dikongsi oleh nsp9 hipotesis coronavirus katak yang berkait jauh, dan mewakili spesies Microhyla letovirus 1 dalam subfamili Letovirinae Alphaletovirus.Pemuliharaan sisa dalam unsur struktur sekunder nsp9 boleh dirasionalkan dengan pertimbangan struktur untuk mengekalkan sifat pengikatan RNA lipatan atau diketahui.Walau bagaimanapun, alasan ini nampaknya tidak digunakan untuk pemuliharaan NNE, dan sebelum kajian ini, sifat kekangan yang mengehadkan variasi jujukan tripeptida telah dikaburkan sepenuhnya.
Untuk menentukan kepentingan pemuliharaan nsp9-NMPylation dan NNE dalam replikasi coronavirus, kami menghasilkan mutan HCoV-229E, yang membawa penggantian tunggal atau berganda bagi residu nsp9 N-terminal, yang menunjukkan bahawa nsp9 NMPylation berbahaya secara in vitro.Sebelum kita mula, kami cuba menjawab soalan sama ada penggantian ini (berhampiran tapak belahan nsp8|9) mempengaruhi pemprosesan proteolitik rantau pp1a terminal-C.Satu set binaan poliprotein nsp7-11 yang mengandungi penggantian sepadan pada terminal N nsp9 telah dihasilkan dalam E. coli dan dipotong dengan Mpro rekombinan.Pembelahan proteolitik bagi empat tapak (termasuk tapak mengapit nsp9) tidak terjejas dengan ketara oleh sebarang penggantian yang diperkenalkan (lampiran SI, Rajah S9), tidak termasuk perubahan struktur dalam protein ini yang mengganggu pembelahan nsp8|9 yang dimediasi Mpro ( Atau lain-lain) laman web.
Sel Huh-7 telah ditransfeksi dengan RNA HCoV-229E panjang genom, pengekodan penggantian Ala atau Ser dalam tripeptida NNE yang dipelihara (N3825, N3826, dan E3827) di terminal nsp9 N, menunjukkan bahawa kebanyakan mutasi adalah membawa maut.Kami dapat menyelamatkan virus dengan menggantikan Ser atau Ala bagi N-terminal Asn (N2835A atau N2835S), tetapi gagal memulihkan virus dengan mutasi tunggal dan berganda lain dalam jujukan NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Rajah 5D).
Keputusan ini menunjukkan bahawa replikasi coronavirus dalam kultur tisu adalah terhad (sama atau serupa), mengehadkan mutasi semula jadi tapak nsp9 NMPylation dalam badan, dan menyokong peranan utama tindak balas ini dalam kitaran hayat coronavirus.
Dalam set eksperimen terakhir, kami menghasilkan C-terminal His6 berlabel SARS-CoV-2 nsp12 dan nsp9, dan dua bentuk mutan nsp12 dalam E. coli.Sisa tapak aktif dalam domain NiRAN dan RdRp masing-masing adalah Gunakan Ala (Rajah 6A dan lampiran SI, Jadual S2).K4465 dalam SARS-CoV-2 nsp12 sepadan dengan K4135 dalam HCoV-229E (Lampiran SI, Rajah S2), yang terbukti diperlukan untuk aktiviti NiRAN dan replikasi HCoV-229E (Rajah 3D dan E).Sisa ini juga sepadan dengan residu virus arteri EAV nsp9 K94, yang sebelum ini ditunjukkan perlu untuk NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16).Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6B, SARS-CoV-2 nsp12 mempunyai aktiviti pemindahan UMP menggunakan nsp9 sebagai substrat, manakala mutan tapak aktif nsp12_K4465A tidak aktif.Penggantian berganda dalam jujukan ciri SDD motif C RdRp tidak menjejaskan aktiviti pemindahan UMP (Rajah 6B), menunjukkan bahawa aktiviti RdRp tidak mempunyai kesan langsung dalam nsp9 UMPylation.Data yang sama diperoleh menggunakan CTP, GTP dan ATP (lampiran SI, Rajah S10).Ringkasnya, data ini menunjukkan bahawa nsp9 NMPylation yang dimediasi NiRAN mempunyai aktiviti konservatif dalam coronavirus yang mewakili genera berbeza subfamili orthocoronavirus.
SARS-CoV-2 nsp12-pengantara NMPilasi nsp9.(A) Gel SDS-polyacrylamide yang diwarnakan oleh Coomassie menunjukkan protein rekombinan yang digunakan dalam ujian NMPylation.Sebagai kawalan, protein mutan dengan penggantian tapak aktif dalam domain NiRAN (K4465A) dan domain RdRp (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12 telah digunakan.Penomboran sisa adalah berdasarkan kedudukan dalam pp1ab.(B) Autoradiograf pengesanan UMPylation menggunakan nsp9-His6 dan [α-32P]UTP sebagai substrat nsp12-His6 (jenis liar [wt] dan mutan).Jisim molekul (dalam kilodalton) protein berlabel ditunjukkan di sebelah kiri.
Domain NiRAN secara amnya dipelihara dalam Nidovirales (16), menunjukkan bahawa ia memangkinkan tindak balas enzim yang penting untuk replikasi Nidovirus.Dalam kajian ini, kami dapat membuktikan bahawa domain NiRAN coronavirus memindahkan NMP (dijana daripada NTP) kepada nsp9, protein pengikat RNA misteri yang terlibat dalam replikasi virus (26 ?? 29), untuk menentukannya sebagai sasaran semula jadi dan rakan kongsi coronavirus RTC.
Domain NiRAN berkongsi tiga motif jujukan (AN, BN, dan CN), yang mengandungi sejumlah kecil sisa yang dipelihara dalam semua keluarga dalam susunan Nidovirales monofiletik tetapi sangat berbeza (8, 16).Kajian terbaru menunjukkan bahawa mereka secara struktur berkaitan dengan keluarga protein seperti kinase protein yang tidak dicirikan, yang pada asalnya dipanggil keluarga SelO (17, 19, 22, 30, 31).Protein berkaitan SelO mempunyai lipatan kinase, tetapi kekurangan beberapa sisa tapak aktif yang dipelihara dalam kinase klasik (22, 32).Berdasarkan orientasi terbalik molekul ATP yang terikat pada tapak aktif dan distabilkan oleh interaksi tertentu, SelO telah dihipotesiskan dan seterusnya disahkan untuk memindahkan AMP (bukan fosfat) ke substrat protein (22), manakala satu lagi protein seperti SelO seperti bakteria YdiU mempunyai baru-baru ini telah ditunjukkan untuk memangkinkan lampiran kovalen UMP kepada Tyr dan sisa-sisa substrat protein yang berbeza (33).
Untuk mengesahkan dan mengembangkan ramalan sisa tapak aktif diduga domain NiRAN coronavirus, kami menggunakan kaedah biokimia dan genetik terbalik untuk melakukan analisis mutasi pada coronavirus nsp12 (Rajah 3D dan E dan lampiran SI, Rajah S3 dan jadual) S1â S4).Data menunjukkan bahawa penggantian HCoV-229E K4135, R4178 dan D4280 dengan Ala menghapuskan aktiviti pemindahan NMP in vitro dan replikasi virus dalam kultur sel (Rajah 3D dan lampiran E dan SI, Rajah S3), menyokong kehadiran mereka dalam NTP γ-fosfat ( K4135, R4178) dan penyelarasan ion logam tapak aktif (D4280).Penggantian E4145A bagi Glu yang dipelihara dalam julat virus sarang burung yang diramalkan untuk menstabilkan kedudukan K4135 (17) ditunjukkan untuk menghapuskan replikasi virus, tetapi yang mengejutkan, aktiviti itu dikekalkan dalam ujian NMPylation in vitro (Rajah 3D dan E dan Lampiran SI, Rajah S3 Dan Jadual S1–S4).Pemerhatian yang sama dibuat apabila penggantian sepadan diperkenalkan dalam homolog YdiU Salmonella typhimurium (E130A) (33).Secara keseluruhan, data ini menyokong fungsi pengawalseliaan sisa terpelihara ini dan bukannya fungsi pemangkin.
Menggantikan residu Phe (F4281A) yang dipelihara dalam julat nestovirus dalam domain HCoV-229E NiRAN (8) mengakibatkan penurunan dalam aktiviti NMPylation in vitro dan penurunan ketara dalam replikasi virus dalam kultur sel (Rajah 3D, E dan SI) lampiran, Rajah S3).Data ini konsisten dengan fungsi pengawalseliaan penting bagi sisa ini, seperti sisa Phe motif DFG homolog yang ditunjukkan sebelum ini.Dalam kinase protein klasik, ia adalah sebahagian daripada gelung pengikat Mg2+ dan membantu untuk memasang dan mengawal tulang belakang???Diperlukan untuk aktiviti pemangkin yang berkesan (32, 34).Menggantikan Ala dan Arg untuk residu K4116 (dalam motif preAN), masing-masing, menghapuskan replikasi virus dan, seperti yang dijangkakan, mempunyai kesan yang berbeza pada aktiviti pemindahan NMP secara in vitro, bergantung pada rantaian sampingan asid amino yang diperkenalkan (Rajah 3D Dan E dan lampiran SI. , Rajah S3).Data berfungsi adalah konsisten dengan maklumat struktur, menunjukkan bahawa sisa ini telah mewujudkan interaksi dengan ATP fosfat (17).Dalam domain NiRAN bagi keluarga virus bersarang lain, kedudukan HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 diduduki oleh Lys, Arg atau His (8), menunjukkan bahawa sekatan fungsi residu khusus ini telah dilonggarkan.Penggantian D4188A dan D4283A menghapuskan atau mengurangkan aktiviti enzim dengan kuat dan menghapuskan replikasi virus (Rajah 3).Kedua-dua sisa ini dipelihara dalam kebanyakan (tetapi tidak semua) virus bersarang (8), menunjukkan fungsi khusus keluarga yang penting tetapi mungkin bukan pemangkin.Penggantian ala beberapa sisa Lys dan Asp lain (K4113A, D4180A, D4197A dan D4273A) yang tidak dipelihara dalam Coronaviridae atau keluarga Nestioviridae lain (8) digunakan sebagai kawalan.Seperti yang dijangkakan, penggantian ini sebahagian besarnya boleh diterima, dengan sedikit penurunan dalam aktiviti enzim dan replikasi virus dalam beberapa kes (Rajah 3 dan lampiran SI, Rajah S3).Secara keseluruhannya, data mutagenesis coronavirus sangat konsisten dengan data genetik GMP kendiri dan terbalik EAV NiRAN-RdRp (16), di mana sisa EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) K94 (bersamaan dengan HCoV- 229E K4135) berfungsi), R124 (bersamaan dengan R4178), D132 (bersamaan dengan D4188), D165 (bersamaan dengan D4280), F166 (bersamaan dengan F4281).Di samping itu, data mutagenesis HCoV-229E adalah konsisten dan berkembang daripada data genetik songsang SARS-CoV yang dilaporkan sebelum ini (16), sama seperti yang diperhatikan untuk motif CN yang sepadan Phe-to-Ala mutan SARS-CoV_nsp12 fenotip diterangkan -F219A dan HCoV-229E_F4281A (Rajah 3 D dan E dan lampiran SI, Rajah S3 dan Jadual S1-S4).
Berbanding dengan ortolog EAV (16), yang mempunyai keutamaan yang jelas untuk UTP dan GTP (dalam tindak balas NMPylation diri), kajian kami menunjukkan bahawa domain coronavirus NiRAN (diwakili oleh HCoV-229E dan SARS-CoV-2) boleh berkesan. dipindahkan Semua empat NMP, walaupun terdapat sedikit keutamaan untuk UMP (Rajah 1 dan 3).Kekhususan yang agak rendah bagi substrat bersama NTP khusus adalah konsisten dengan struktur superkomposit nsp7/8/12/13 SARS-CoV-2 yang dilaporkan baru-baru ini, di mana ADP-Mg2+ mengikat tapak aktif NiRAN, tetapi tidak dengan Bahagian adenina pembentukan interaksi khusus (17).Dalam kajian kami, jenis nukleotida yang digunakan dalam tindak balas NMPylation tidak mempunyai kesan pembezaan ke atas aktiviti protein mutan (Lampiran SI, Rajah S3), menunjukkan bahawa tiada residu ini berkait rapat dengan pengikatan nukleobase tertentu.Asas struktur dan potensi kepentingan biologi bagi pilihan substrat bersama NTP berbeza yang diperhatikan dalam domain NiRAN bagi coronavirus dan virus arteri masih perlu dikaji;mereka mungkin benar atau mungkin disebabkan oleh keterbatasan pengajian masing-masing.Pada masa ini, tidak boleh diketepikan bahawa potensi aktiviti NMPylator bagi domain NiRAN virus arteri (berbanding dengan aktiviti NMPylation diri yang dicirikan sebelum ini) mempunyai keutamaan substrat bersama yang berbeza, dengan mengambil kira persamaan antara arteri dan coronavirus. Domain NiRAN berada pada hadnya.Berasaskan jujukan Bandingkan (16).Berbanding dengan pseudokinase SelO, yang menggunakan Mg2+ sebagai kofaktor, aktiviti coronavirus dan virus arteri NiRAN adalah bergantung kepada Mn2+ (16) (Rajah 3C dan lampiran SI, Rajah S1).Kebergantungan Mn2+ dan keutamaan yang jelas untuk UTP ialah ciri luar biasa NMPylators protein, dan baru-baru ini telah disahkan dalam protein YdiU Salmonella typhimurium, yang memangkinkan UMPylation pendamping protein yang bergantung kepada Mn2+ yang ketat untuk melindungi sel daripada kumpulan ATP Sel induksi tekanan ( 33).
Persamaan struktur yang diterangkan baru-baru ini antara domain coronavirus NiRAN dan kinase protein selular (17, 19) memberikan sokongan tambahan untuk keupayaan NiRAN untuk menghubungkan NMP secara kovalen kepada protein lain yang telah kami laporkan dalam kajian ini.Kami menumpukan carian kami untuk kemungkinan sasaran NiRAN pada protein yang dikodkan oleh HCoV-229E ORF1a, yang diketahui secara langsung atau tidak langsung membantu replika RTC yang dikodkan ORF1b (12, 35).Eksperimen kami memberikan bukti konklusif untuk NMPylation berkesan dan spesifik bagi nsp9 (Rajah 2).Jika protein sasaran digunakan dalam lebihan molar yang 8 hingga 10 kali lebih tinggi daripada enzim (nsp12), ia disahkan bahawa nsp9 sepenuhnya (mono)NMPized (Rajah 4).Kami membuat kesimpulan bahawa interaksi antara nsp12 dan nsp9 adalah jangka pendek dan tidak akan membentuk kompleks yang stabil dengan nsp9 (tanpa ketiadaan subunit RTC lain).Kesimpulan ini disokong oleh kajian interaksi protein pada proteom SARS-CoV (35).Analisis MS mengenal pasti amina utama residu N-terminal nsp9 sebagai tapak NMPylation (lampiran SI, Rajah S5).Pembentukan ikatan fosforamidat dan kumpulan amino terminal-N membezakan aktiviti NMPylation yang dimediasi NiRAN daripada tindak balas AMPylation yang dimediasi SelO Pseudomonas syringae, yang memangkinkan pembentukan AMP yang dikaitkan dengan O pada sisa Ser, Thr, atau Tyr residu Peptide adduct ( 22), dan S. typhimurium YdiU membentuk tambahan O-linked (dengan Tyr) dan N-linked (dengan His) peptida-UMP.Maklumat terhad yang terdapat pada keluarga protein SelO menunjukkan bahawa ahli keluarga protein besar ini sangat berbeza dalam pembentukan tambahan peptida-NMP.Ini adalah pemerhatian yang menarik yang patut dikaji lebih lanjut.
Data yang diperoleh dalam kajian ini membawa kami membuat hipotesis bahawa NMPylation nsp9 memerlukan terminal N percuma.Dalam konteks replikasi virus, ini akan disediakan oleh belahan proteolitik tapak pemprosesan nsp8|nsp9 dalam poliprotein replika pp1a yang dimediasi oleh Mpro dan pp1ab.Dalam kebanyakan coronavirus, perbezaan antara tapak khusus ini (VKLQ|NNEI dalam HCoV-229E) dan semua tapak belahan Mpro coronavirus lain ialah Asn (bukan sisa kecil lain, seperti Ala, Ser Atau Gly) menduduki P1â???Lokasi (36).Data belahan peptida yang diperoleh dalam kajian awal menunjukkan bahawa kecekapan belahan tapak nsp8|nsp9 adalah lebih rendah daripada tapak lain, menunjukkan bahawa 1) tapak khusus ini mungkin mempunyai peranan pengawalseliaan dalam pemprosesan terkoordinasi C-terminal yang tepat pada masanya. rantau pp1a, atau 2) a Peranan terminal N-nsp9 terpelihara khas dalam replikasi virus (37).Data kami (Rajah 5A) menunjukkan bahawa bentuk rekombinan nsp9 yang membawa jujukan N-terminal sebenar telah secara berkesan NMPized oleh nsp12.Jujukan mengapit N-terminal telah dikeluarkan oleh faktor Xa (nsp9-His6; lampiran SI, Jadual S1) atau belahan pengantara Mpro (nsp7-11-His6; Rajah 5A dan lampiran SI, Jadual S1).Yang penting, prekursor yang mengandungi nsp9 yang tidak dipotong nsp7-11-His6 menunjukkan ketahanan terhadap NMPylation nsp12, yang konsisten dengan data kami, menunjukkan bahawa penambahan nsp9-NMP terbentuk melalui amina primer N-terminal ( lampiran SI, Rajah S5) .Untuk mendapatkan pemahaman yang lebih mendalam tentang kekhususan substrat NiRAN, kami kemudiannya menumpukan pada residu N-terminal bersebelahan nsp9.Dengan ketiadaan protein lain, ia fleksibel dari segi struktur, menghalangnya daripada dikesan dalam bentuk nsp9 yang tidak berlabel (26 28, 38), menunjukkan variasi semula jadinya yang terhad Ini disebabkan oleh urutan penting yang khusus (bukan berkaitan struktur sekunder) fungsi serpihan nsp9 N-terminal.Penggantian sisa sisa terpelihara di rantau ini (Rajah 5C dan D dan lampiran SI, Rajah S8) mendedahkan bahawa N3826 adalah penting untuk nsp9 NMPylation in vitro, manakala penggantian N3825A dan E3827A membawa kepada penurunan dalam pengilangan, manakala penggantian M3829A dan P3830A tidak dilakukan. .Jelas sekali menjejaskan nsp9 NMPylation.Walaupun penggantian N-terminal Asn (N3825A, N3825S) hanya mempunyai kesan sederhana pada nsp9 NMPylation dan replikasi virus dalam kultur sel (Rajah 5C dan D), pemadaman jujukan residu Asn daripada N-terminal 3825-NN dipeptide terbukti Ia membawa maut kepada virus, menunjukkan bahawa satu residu Asn diperlukan sebelum residu lain di terminal-N, sebaik-baiknya Asn, walaupun nampaknya penggantian sisa yang serupa boleh diterima sebahagiannya (Rajah 5B, C, dan D).Kami menyimpulkan bahawa dipeptida 3825-NN, terutamanya sisa N3826 yang dipelihara dan penting dalam julat coronavirus (lampiran SI, Rajah S6), memastikan pengikatan dan orientasi yang betul bagi nsp9 N-terminus dalam tapak aktif NiRAN.
Menggantikan Ala (E3827A) untuk Glu yang dipelihara bagi semua subfamili mengekalkan nsp9 NMPylation in vitro tetapi boleh membawa maut kepada virus dalam kultur sel (Rajah 5C dan D), yang menunjukkan fungsi tambahan sisa ini, contohnya, dalam interaksi utama (NMPylated atau tidak diubah suai. ) nsp9 N-terminus dan faktor lain yang terlibat dalam replikasi virus.Mutasi Nsp9 tidak menjejaskan proses proteolitik nsp9 atau mana-mana nsps bersebelahan (39) (Lampiran SI, Rajah S9), menunjukkan bahawa fenotip maut beberapa mutasi nsp9 yang diperhatikan tidak disebabkan oleh disregulasi kawasan pp1a terminal proses proteolitik C .
Data di atas memberikan bukti bahawa selepas rawatan pengantara Mpro bagi tapak belahan nsp8|9 dalam pp1a/pp1ab, terminal-N nsp9 boleh UMPylated (atau sebahagiannya diubah suai dengan NMP yang lain).Di samping itu, pemuliharaan cemerlang N-terminus nsp9 (termasuk sisa Asn tunggal dan invarian dalam keluarga coronavirus) dan data genetik terbalik yang diperoleh dalam kajian ini (Rajah 3E dan 5D) membawa kami untuk membuat kesimpulan bahawa nsp9 NMPylation yang dijelaskan. adalah berkaitan secara biologi dan penting untuk replikasi coronavirus.Akibat fungsi pengubahsuaian ini masih perlu dikaji, sebagai contoh, mengenai aktiviti mengikat RNA (tidak spesifik) nsp9 (bentuk tidak diubah suai) yang diterangkan sebelumnya (2628).NMPylation N-terminal juga boleh menjejaskan interaksi nsp9 dengan protein atau substrat RNA atau pembentukan perhimpunan empat peringkat yang berbeza.Ini telah diperhatikan dalam kajian struktur dan telah disahkan mempunyai kaitan secara fungsional dengan replikasi coronavirus, walaupun terutamanya jika tiada Dalam kes pengubahsuaian ini (26- ââ29, 40).
Walaupun kekhususan sasaran domain NiRAN coronavirus masih perlu dicirikan dengan lebih terperinci, data kami menunjukkan bahawa kekhususan sasaran protein domain NiRAN coronavirus adalah sangat sempit.Walaupun pemuliharaan sisa tapak aktif utama (8, 16) dalam domain NiRAN semua keluarga nidovirus sangat menyokong aktiviti NMPylator yang dipelihara protein ini, identiti residu poket pengikat substrat domain ini Pemuliharaan dan pemuliharaan masih perlu dicirikan. , dan mungkin berbeza antara keluarga berlainan tujuan Nidovirales.Begitu juga, sasaran berkaitan virus bersarang lain masih belum ditentukan.Mereka mungkin ortolog jauh nsp9 atau protein lain, kerana jujukan di luar lima domain replika yang umumnya dipelihara dalam virus bersarang kurang dipelihara (8), termasuk tatasusunan genom antara Mpro dan NiRAN, Antaranya, nsp9 terletak di koronavirus.
Di samping itu, pada masa ini kami tidak boleh menolak kemungkinan bahawa domain NiRAN mempunyai sasaran tambahan (termasuk selular).Dalam kes ini, perlu disebutkan bahawa homolog bakteria dalam NMPylators protein yang muncul (NMPylators) (30, 31) nampaknya mempunyai "pengawal selia induk"?NMP memodulasi pelbagai protein selular untuk mengawal atau menghapuskan aktiviti hiliran mereka, dengan itu memainkan peranan dalam pelbagai proses biologi, seperti tindak balas tekanan selular dan homeostasis redoks (22, 33).
Dalam kajian ini (Rajah 2 dan 4 dan Lampiran SI, Rajah S3 dan S5), kami dapat membuktikan bahawa nsp12 memindahkan bahagian UMP (NMP) ke kedudukan tunggal (dipelihara) dalam nsp9, manakala protein lain tidak diubah suai dalam digunakan Di bawah keadaan, kekhususan substrat yang jelas (bukannya longgar) disokong.Selaras dengan ini, berbanding dengan N-terminal nsp9 NMPylation, aktiviti NMPylation nsp12 sendiri adalah sangat rendah, pengesanannya memerlukan masa pendedahan autoradiografi yang lebih lama, dan peningkatan 10 kali ganda dalam kepekatan nsp12 digunakan.Di samping itu, analisis MS kami gagal memberikan bukti untuk NMPylation of nsp12, yang menunjukkan bahawa domain NiRAN self-NMPylation adalah (paling baik) aktiviti sekunder.Walau bagaimanapun, perlu diingatkan bahawa kajian lain telah memberikan bukti awal bahawa status AMPilasi diri NMPylator bakteria boleh mengawal aktiviti NMPylation mereka pada substrat protein lain (22, 33).Oleh itu, lebih banyak penyelidikan diperlukan untuk menyiasat kemungkinan kesan fungsi aktiviti NMPylation diri yang dilaporkan untuk EAV nsp9 (16) dan coronavirus nsp12 (kajian ini), termasuk kesan seperti pendamping yang dicadangkan pada lipatan domain RdRp terminal-C ( 16) ).
Sebelum ini, beberapa hipotesis mengenai kemungkinan fungsi hiliran domain NiRAN nidoviral telah dipertimbangkan, termasuk RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase dan aktiviti penyebuan protein (16), tetapi tiada satu pun daripada mereka yang serasi dengan fungsi hiliran yang tersedia.Maklumat yang diperolehi dalam kedudukan berikut adalah tepat pada masa yang sama tanpa membuat andaian tambahan.Data yang diperolehi dalam kajian ini adalah paling konsisten dengan (tetapi tidak dapat membuktikan) bahawa domain NiRAN terlibat dalam permulaan sintesis RNA yang disebabkan oleh protein.Sebelum ini dipercayai bahawa fungsi domain NiRAN dalam 5??Reaksi pengikatan ²-RNA atau pengikatan RNA tidak terjejas oleh ini dan Sokongan data lain.Oleh itu, sebagai contoh, tapak aktif NiRAN dianggap melibatkan Asp terpelihara sebagai asas am (D252 dalam Pseudomonas syringae SelO; D4271 dalam HCoV-229E pp1ab; D208 dalam SARS-CoV-2 nsp12) (Lampiran SI, rajah 2 ).S2) (17, 22, 33), manakala pemangkinan dalam ligase RNA yang bergantung kepada ATP dan enzim penutup RNA dijalankan oleh perantaraan enzim kovalen-(lysyl-N)-NMP, yang melibatkan residu Lys yang tidak Berubah ( 41).Di samping itu, kekhususan berasaskan jujukan yang luar biasa bagi coronavirus NiRAN untuk sasaran protein terpelihara dan kekhususan santai untuk substrat bersama NTP (lebih suka UTP) menentang enzim penutup pengantara NiRAN atau fungsi seperti ligase RNA.
Jelas sekali, banyak kerja tambahan diperlukan untuk mengesahkan dan, jika terbukti, menghuraikan kemungkinan peranan nsp9-UMP (nsp9-NMP) dalam sintesis RNA yang disebabkan oleh protein, yang akan menghubungkan beberapa laporan yang menarik tetapi (setakat ini) yang dilaporkan sebelum ini .Pemerhatian terpencil.Sebagai contoh, telah ditentukan bahawa penghujung RNA untaian negatif coronavirus bermula dengan untaian oligo(U) (42, 43).Pemerhatian ini konsisten dengan idea bahawa sintesis RNA untai negatif dimulakan dengan mengikat bentuk UMPylated nsp9 ke ekor poli(A) ( pencetus), yang mungkin digalakkan oleh pengikatan RNAnya Aktiviti dan/atau interaksi dengan satu lagi protein RTC.Bahagian UMP yang disediakan oleh nsp9 kemudiannya boleh digunakan sebagai "primer" untuk oligouridilasi pengantara nsp7/8/nsp12, menggunakan ekor 3??²-poli(A) dalam RNA genomik atau Satu lagi urutan yang mengandungi oligo (A) berfungsi sebagai templat, serupa dengan mekanisme yang ditubuhkan untuk protein VPg picornavirus (44).Bagaimana jika cadangan itu "tidak normatif"????Permulaan sintesis RNA untai negatif (yang disebabkan oleh protein) menyediakan pautan kepada pemerhatian, menunjukkan bahawa RNA untai negatif coronavirus mempunyai UMP (bukan UTP) pada penghujungnya (42), yang dianggap menunjukkan bahawa asid nukleik Dicer membelah hujung yang difosforilasi oleh endonuklease khusus uridin yang tidak diketahui.Jika disahkan, aktiviti hidrolitik asid nukleik ini boleh membantu melepaskan bentuk UMPylated oligomerik nsp9 dari hujung 5 ² helai negatif yang baru lahir.Kemungkinan peranan nsp9 dalam penyebuan protein juga konsisten dengan kajian genetik terbalik sebelumnya, yang telah menunjukkan bahawa nsp9 (dan nsp8) berinteraksi secara kritikal dan khusus dengan unsur RNA bertindak cis yang dipelihara berhampiran hujung 3 genom coronavirus.45).Menurut laporan ini, pemerhatian terdahulu ini kini boleh dikaji semula dan diperluaskan melalui penyelidikan lanjut.
Ringkasnya, data kami menentukan aktiviti khusus tag enzim virus bersarang proprietari yang dipautkan kepada RdRp di terminal-N.Dalam coronavirus, aktiviti UMPylator/NMPylator pengantara NiRAN yang baru ditemui ini digunakan untuk bergantung pada Mn2+ dan sisa Asn bersebelahan dan menyebabkan pembentukan ikatan fosforamidat (tenaga rendah) dengan amina primer terminal-N.Melalui belahan pengantara Mpro di tapak belahan nsp8|9, sasaran nsp9 boleh digunakan untuk NMPylation, menunjukkan gandingan berfungsi antara protease dan domain NiRAN, yang memanjang ke RdRp.Pemuliharaan sisa utama dalam tapak aktif nsp12 NiRAN dan sasaran nsp9, digabungkan dengan data yang diperoleh daripada dua coronavirus termasuk SARS-CoV-2, memberikan bukti kukuh bahawa nsp9 NMPylation ialah coronavirus Ciri konservatif juga merupakan langkah penting dalam replikasi virus.Data yang tersedia membawa kami untuk membuat kesimpulan bahawa peranan khusus bentuk nsp9 yang disertakan dalam sintesis RNA yang disebabkan oleh protein ialah senario yang munasabah untuk coronavirus dan virus bersarang lain, dan NiRAN juga mungkin menyasarkan protein lain yang tidak dikenal pasti.Kawal selia virus.Interaksi hos.Jika disahkan, penglibatan primer protein dalam sintesis RNA virus akan meningkatkan pertalian jujukan domain Mpro/3CLpro dan RdRp antara coronavirus yang dikesan sebelum ini dan superkumpulan seperti picornavirus (9), yang kini telah disatukan dalam Pisonivirite yang baru ditubuhkan ( 46) dalam kategori.
Data kami juga menunjukkan bahawa aktiviti enzim asas, selektif dan konservatif yang dikenal pasti dalam kajian ini boleh digunakan sebagai sasaran untuk ubat antiviral.Sebatian yang mengganggu pengikatan (dan pengubahsuaian seterusnya) terminal nsp9 N yang dipelihara di tapak aktif NiRAN boleh dibangunkan menjadi ubat antivirus yang berkesan dan serba boleh, sesuai untuk rawatan coronavirus haiwan dan manusia daripada Jangkitan (sub)genus yang berbeza , termasuk SARS-CoV-2 dan Koronavirus Sindrom Pernafasan Timur Tengah.
Urutan pengekodan protein coronavirus yang dihasilkan dalam kajian ini telah dikuatkan oleh RT-PCR menggunakan RNA yang diasingkan daripada Huh-7 yang dijangkiti HCoV-229E atau Vero E6 yang dijangkiti SARS-CoV-2, dan dimasukkan menggunakan prosedur pengklonan standard.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) atau vektor ekspresi pASK3-Ub-CHis6 (47) (Lampiran SI, Jadual S1 dan S2).Penggantian kodon tunggal telah diperkenalkan oleh mutagenesis terarah tapak berasaskan PCR (48).Untuk menghasilkan protein gabungan MBP, sel E. coli TB1 telah diubah dengan konstruk plasmid pMAL-c2 yang sesuai (lampiran SI, Jadual S1).Protein gabungan telah disucikan oleh kromatografi afiniti amilosa dan dibelah dengan faktor Xa.Selepas itu, protein C-terminal His6-tag telah disucikan oleh kromatografi pertalian logam tidak bergerak Ni (Ni-IMAC) seperti yang diterangkan sebelum ini (49).Untuk menghasilkan protein gabungan ubiquitin, sel E. coli TB1 menggunakan konstruk plasmid pASK3-Ub-CHis6 yang sesuai (Lampiran SI, Jadual S1 dan S2) dan pengekodan DNA plasmid pCGI ubiquitin-spesifik C-terminal hidrolase 1 (Ubp1).Transformasi (47).Protein coronavirus bertanda C-terminal His6 telah disucikan seperti yang diterangkan sebelum ini (50).
Ujian NMPylation diri HCoV-229E nsp12-His6 telah dilakukan seperti yang diterangkan dalam EAV nsp9 (16).Ringkasnya, nsp12-His6 (0.5 µM) mengandungi 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol ( DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM penimbal NTP dan 0.17 µM yang ditentukan sepadan dengan [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Analitik Hartmann) pada 30 °C selama 30 minit.Dalam semua ujian NMPilasi (standard) lain bagi nsp12-pengantara nsp9 NMPilasi, keadaan tindak balas diselaraskan seperti berikut: nsp12-His6 (0.05 µM) dan nsp9-His6 (4 µM) dengan kehadiran 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM menunjukkan NTP dan 0.17 µM dipadankan [α32-P]NTP.Selepas mengeram selama 10 minit pada suhu 30°C, sampel tindak balas dicampur dengan penimbal sampel SDS-PAGE: 62.5 mM tris(hidroksimetil)aminometana HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% gliserol dan 0.005% bromophenol biru.Protein telah didenaturasi dengan memanaskan pada 90 ° C selama 5 minit dan dipisahkan oleh 12% SDS-PAGE.Gel dibetulkan dan diwarnakan dengan larutan Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% asid asetik, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), dinyahwarna dan terdedah kepada skrin pengimejan berpendar selama 20 jam (untuk mengesan nsp12 daripada NMPylation) atau (maksimum) 2 Jam (untuk menilai nsp9 NMPylation).Pengimej Typhoon 9200 (GE Healthcare) digunakan untuk mengimbas skrin dan ImageJ digunakan untuk menganalisis keamatan isyarat.
Untuk analisis MS, 1 µM nsp12-His6 dan 10 µM nsp9 (tanpa tag hexahistidine) telah digunakan dalam analisis NMPylation (lampiran SI, Jadual S1) dan peningkatan kepekatan 500 µM UTP dan GTP telah digunakan.Bergantung pada kepekatannya dan kualiti protein yang dijangkakan, sistem HPLC Kelas H Waters ACQUITY yang dilengkapi dengan lajur MassPrep (Waters) telah digunakan untuk menyah garam 1 hingga 10 µL larutan protein tertimbal dalam talian.Protein ternyah garam dicairkan ke dalam sumber ion elektrospray spektrometer jisim Synapt G2Si (Air) melalui kecerunan penampan A (air/0.05% asid formik) dan penimbal B (acetonitrile/0.045% asid formik) berikut, dan suhu lajur ialah 60 ° C dan kadar alir 0.1 mL/min: elusi secara isokratik dengan 5% A selama 2 minit, kemudian kecerunan linear kepada 95% B dalam masa 8 minit, dan mengekalkan 95% B selama 4 minit lagi.
Ion positif dengan julat jisim 500 hingga 5000 m/z dikesan.Glu-fibrinopeptide B diukur setiap 45 saat untuk pembetulan hanyutan jisim automatik.Gunakan perisian instrumen MassLynx dengan sambungan MaxEnt1 untuk menyahkonversi spektrum purata selepas menolak garis dasar dan pelicinan.
UMPylated HCoV-229E nsp9 telah dicerna dengan menambahkan trypsin (Serva) diubah suai gred jujukan dan diinkubasi semalaman pada suhu 37 °C.Lajur putaran Chromabond C18WP (nombor bahagian 730522; Macherey-Nagel) digunakan untuk nyah garam dan menumpukan peptida.Akhirnya, peptida telah dibubarkan dalam 25 µL air, yang mengandungi 5% asetonitril dan 0.1% asid formik.
Sampel dianalisis oleh MS menggunakan spektrometer jisim Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Sistem HPLC nanoâ muktamad (Dionex), dilengkapi dengan pemasangan hujung tersuai 50 cm??Lajur C18 RP 75 μm padat dengan manik magnet 2.4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Sambungkan kepada spektrometer jisim dalam talian melalui sumber semburan nano Proxeon;menyuntik 6 µL larutan penghadaman tripsin ke dalam diameter dalam 300 µm ×??1 sm C18 lajur pra-pekatan PepMap (Thermo Scientific).Menggunakan air/0.05% asid formik sebagai pelarut, sampel secara automatik terperangkap dan dinyahgalin pada kadar aliran 6 µL/min.
Kecerunan air/0.05% asid formik (pelarut A) dan 80% asetonitril/0.045% asid formik (pelarut B) berikut digunakan untuk mencapai pemisahan peptida tryptic pada kadar aliran 300 nL/min: 4% B untuk 5 minit, kemudian 30 A kecerunan linear kepada 45% B dalam beberapa minit, dan peningkatan linear kepada 95% pelarut B dalam masa 5 minit.Sambungkan lajur kromatografi kepada pemancar nano keluli tahan karat (Proxeon), dan sembur eluen terus ke kapilari dipanaskan spektrometer jisim menggunakan potensi 2,300 V. Imbasan tinjauan dengan resolusi 60,000 dalam penganalisis jisim Orbitrap dikaitkan dengan sekurang-kurangnya tiga imbasan MS/MS data, dikecualikan secara dinamik selama 30 saat, menggunakan pemisahan akibat perlanggaran perangkap ion linear atau pemisahan perlanggaran tenaga yang lebih tinggi digabungkan dengan pengesanan orbitrap , Resolusinya ialah 7,500.
Masa siaran: Ogos-03-2021